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除非特别说明，所有步骤或处理均在室温（22℃ 左右）中进行。
（一）精液的收集
禁欲 3～ 5d后，通过手淫射出的精液被收集在容积为 80～ 100mL 的无菌聚丙烯塑料容器中。然后在 90min内按冷冻保存的要求进行处理，同时观察与测量必要的参数。若符合标准，就全部用于冷冻保存。
（二）精液体积的测量
当凝集的精液液化时，就可用带针头的 5mL 注射器吸入精液以测定其体积，然后再注回容器中作甘油化处理。此时可取出少量精液（约 0.2mL）作精液分析（观察活动精子的百分数、类型和持续时间、活力染色，精子密度及异常精子）、检查性病（包括艾滋病）的病原体和（或）抗血清，必要时应作精液培养。根据医师相对工作量和时间安排的习惯，可以从为确定冷冻生存（活动能力）而解冻的质量控制管中取出精液，作精子密度和异常精子的观察和测量以及培养。这也能在冷冻程序结束后选择方便的时间进行，只要吸管在液氮内即可。然而，存活力染色测量应在冷冻前和解冻后的样品中进行。活动力的观察也应同时进行。
（三）甘油化
将精液置于混旋器上混旋，同时逐渐把甘油滴入其中，每 2 滴之间相隔 1min。每毫升精液中加入 3滴甘油，则甘油浓度约为 12% ～ 15% ，没必要精确定量，因为在这一浓度范围内，精液冷冻保存的效果是一样的。然而有的实验室结果表明甘油浓度在 5% ～ 10% 范围内，冷冻保存效果没有差别。
（四）分装
每份精液冷冻前可用若干容积为 0.6mL 的聚丙烯塑料管来分装，用记号笔作上相应的标记，如精液提供者、患者或精液存放者的编号及日期。分装准备工作也能在测量精液体积后或在收集精液之前进行。根据正常供精者或精液寄存者精液体积的平均值来确定所需吸管的数目。除精液贮存管外，还要准备一根体积小一些（约 0.3mL）的质控测试吸管，用以在贮存之前吸取少量精液作为检测冷冻存活百分数的质控样品。为确定精子功能丧失的程度和时间，并测定其冷冻存活率，对于收集后尚未处理的新鲜精液、冷冻保护剂处理后的精液及冻-融后的精液均需观察精子活动率及其质量。
可使用容积为 2～ 3mL 塑料注射器带有一内径为 3mm 左右的接口，将精液吸入后再注入到塑料吸管。甘油化的精液被定量加入吸管，开口端用吸水纸擦干以备封口，先用硬尼龙塞子塞入每根吸管的开口端，然后放在桌上压紧，并在吸管上端向下垂直加压以完全封口；重复上述步骤封住从注射器上拔下的另一端。因为一端已经封住，这样就可在封吸管另一端时避免精液丢失。在装入经冷冻保护剂处理后的精液时，吸管内应留下足够的空间，以便用塞子封口，且可避免冷冻过程中因冰的膨胀而将密封塞顶掉，也可避免解冻时精液的丢失或污染。用以加样的标本管应在使用前作记号（线或点），这样就能指示加样的最大容量，并可为塞子及冷冻膨胀留出足够空间。尼龙塞封口可简便地适应一部分精液包装，如待测样品的准备、质控和筛选，在加样、封口、冷冻、贮存或解冻过程中，这种简便而有效的分装方法很少会出现什么问题，利用这种塑料管贮存精液还便于最有效地节省贮存空间。
（五）冷冻
装有已甘油化精液样品并已标记和封口的吸管，就可插入金属架的铝套内。这些套管要有与插入其中的吸管一一对应的标记，以便以后找寻样品。套管底部打一个孔，便于贮存时让液氮进入以浸泡密封的吸管。
冷冻的方法一般有两种：一是在机械（电子）低温冰箱约 - 83℃ 的冷气中冷冻；二是在液氮罐内液氮水平面上的气雾中冷冻。两者都应持续 30～ 60min的冷冻时间。有人将同一个样品分成两部分进行研究，显示两种方法对于精子冷冻存活无区别。但液氮法更简单，更便宜而且所需的设备是可携带的，可以在实验室外的门诊甚至远离实验室的地方进行冷冻。可以使用各种大小的液氮贮存器，只要冷冻时样品悬挂在气雾中，不管有没有特别的冷冻小罐。许多实验室都使用改进的液氮气雾冷冻法，但主要原理是一样的。精液不论是放在管子或其他容器中都应悬挂在液氮气雾之中。各种容器无论放置在金属架、盘子、套管或罐内，无论垂直、水平或倾斜放置，均能成功地冷冻贮存。
（六）储存
将已经冷冻好的装有样品的吸管很快地用预冷的镊子放入已有适当标记的雪茄状铝质套管中，迅速把它盖紧后置于预冷的标记铝罐中，然后很快转入液氮中的贮存罐内，放在低温冰箱内便于迅速找寻的位置。对用另一种方法冷冻的铝套管内的样品管也可以同样方式贮存。标记必须清楚且有助于准确地鉴别出贮存的精液样品，以便在使用的目录系统中很快能找到。
（七）解冻
将样品管于室温下浸在自来水或双蒸水中或仅仅暴露于空气之中（两者均在室温下22℃ 左右进行），就能使冷冻于样品管内的精液解冻。用同一样品进行比较研究显示两种解冻方法对精子冷冻存活并无差异。
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